ДНК-вакцина - DNA vaccine

Создание ДНК-вакцины.

ДНК - вакцина представляет собой тип вакцины , что transfects специфического антигена -coding ДНК последовательности в клетки организма в качестве механизма для индукции иммунного ответа.

ДНК-вакцины работают путем инъекции генно-инженерной плазмиды, содержащей последовательность ДНК, кодирующую антиген (ы), против которых требуется иммунный ответ, поэтому клетки непосредственно производят антиген, вызывая тем самым защитный иммунологический ответ . ДНК-вакцины имеют теоретические преимущества перед обычными вакцинами, включая «способность вызывать более широкий спектр типов иммунного ответа». Несколько ДНК-вакцин были протестированы для использования в ветеринарии . В некоторых случаях защита от болезней у животных была получена, в других - нет. Продолжаются исследования подхода к вирусным, бактериальным и паразитарным заболеваниям человека, а также к раковым заболеваниям. В августе 2021 года власти Индии дали экстренное разрешение ZyCoV-D . Разработанная Cadila Healthcare , это первая ДНК-вакцина, одобренная для людей.

История

Обычные вакцины содержат либо специфические антигены патогена, либо ослабленные вирусы, которые стимулируют иммунный ответ в вакцинированном организме. ДНК-вакцины являются членами генетических вакцин , потому что они содержат генетическую информацию (ДНК или РНК), которая кодирует клеточную продукцию ( биосинтез белка ) антигена . ДНК-вакцины содержат ДНК, которая кодирует специфические антигены патогена. ДНК вводится в организм и поглощается клетками, чьи нормальные метаболические процессы синтезируют белки на основе генетического кода в плазмиде, которую они приняли. Поскольку эти белки содержат участки аминокислотных последовательностей, характерных для бактерий или вирусов, они распознаются как чужеродные, и когда они обрабатываются клетками-хозяевами и отображаются на их поверхности, иммунная система получает сигнал, который затем запускает иммунные ответы. Альтернативно, ДНК может быть инкапсулирована в белок для облегчения проникновения в клетки. Если этот капсидный белок включен в ДНК, полученная вакцина может сочетать в себе эффективность живой вакцины без риска реверсии.

В 1983 году Энцо Паолетти и Деннис Паникали из Министерства здравоохранения Нью-Йорка разработали стратегию производства рекомбинантных ДНК- вакцин с использованием генной инженерии для преобразования обычной противооспенной вакцины в вакцины, которые могут предотвратить другие заболевания. Они изменили ДНК вируса коровьей оспы, вставив ген из других вирусов (а именно вируса простого герпеса , гепатита В и гриппа ). В 1993 году Джеффри Улмер и его сотрудники из исследовательских лабораторий Merck продемонстрировали, что прямая инъекция мышам плазмидной ДНК, кодирующей антиген гриппа, защищает животных от последующего экспериментального заражения вирусом гриппа. В 2016 году ДНК-вакцина против вируса Зика начала тестироваться на людях в Национальном институте здравоохранения . В исследовании планировалось принять участие до 120 человек в возрасте от 18 до 35 лет. Отдельно компании Inovio Pharmaceuticals и GeneOne Life Science начали испытания другой ДНК-вакцины против вируса Зика в Майами. Вакцина NIH вводится в плечо под высоким давлением. Производство вакцин в больших объемах оставалось нерешенным по состоянию на август 2016 года. Клинические испытания ДНК-вакцин для предотвращения ВИЧ продолжаются.

В августе 2021 года власти Индии выдали ZyCoV-D экстренное разрешение. Разработанная Cadila Healthcare , это первая ДНК-вакцина против COVID-19 .

Приложения

По состоянию на 2021 год ни одна ДНК-вакцина не была одобрена для использования человеком в Соединенных Штатах. Несколько экспериментальных испытаний вызвали реакцию, достаточно сильную, чтобы защитить от болезней, и полезность метода еще предстоит доказать на людях. Утверждена ветеринарная ДНК-вакцина для защиты лошадей от вируса Западного Нила. ДНК-иммунизация также исследуется как средство разработки сывороток против яда. ДНК-иммунизация может использоваться в качестве технологической платформы для индукции моноклональных антител.

Преимущества

• Нет риска заражения
• Антиген презентация как MHC класса I и класса II молекул
• Поляризация ответа Т-клеток в сторону типа 1 или типа 2
• Иммунный ответ, сфокусированный на интересующем антигене
• Легкость разработки и производства
• Стабильность при хранении и транспортировке
• Рентабельность
• Устраняет необходимость в синтезе пептидов, экспрессии и очистке рекомбинантных белков и использовании токсичных адъювантов.
• Длительное сохранение иммуногена
• Экспрессия in vivo гарантирует, что белок более близок к нормальной эукариотической структуре с сопутствующими посттрансляционными модификациями.

Недостатки

• Ограничено белковыми иммуногенами (не используется для антигенов небелковой основе, таких как бактериальные полисахариды)
• Возможна атипичная переработка белков бактерий и паразитов.
• Возможность при использовании назального спрея введения наночастиц плазмидной ДНК для трансфекции нецелевых клеток, таких как клетки мозга.
• Перекрестное заражение при производстве разных типов живых вакцин на одном предприятии

Плазмидные векторы

Векторный дизайн

ДНК-вакцины вызывают лучший иммунный ответ при использовании векторов с высокой экспрессией. Это плазмиды, которые обычно состоят из сильного вирусного промотора, управляющего транскрипцией и трансляцией in vivo интересующего гена (или комплементарной ДНК ). Иногда может быть включен интрон А для улучшения стабильности мРНК и, следовательно, увеличения экспрессии белка. Плазмиды также включают сильный сигнал полиаденилирования / терминации транскрипции , такой как последовательности полиаденилирования бычьего гормона роста или бета-глобулина кролика . Полицистронные векторы (с множеством представляющих интерес генов) иногда конструируют для экспрессии более чем одного иммуногена или для экспрессии иммуногена и иммуностимулирующего белка.

Поскольку плазмида, несущая относительно небольшой генетический код размером примерно до 200 тыс. Пар оснований,  является «носителем», из которого экспрессируется иммуноген, оптимизация дизайна вектора для максимальной экспрессии белка имеет важное значение. Одним из способов повышения экспрессии белка является оптимизация использования кодонов патогенных мРНК для эукариотических клеток. Патогены часто имеют другое содержание AT, чем виды-мишени, поэтому изменение последовательности гена иммуногена для отражения кодонов, более часто используемых в видах-мишенях, может улучшить его экспрессию.

Еще одно соображение - выбор промоутера . SV40 , промотор обычно используют до тех пор , пока исследование показало , что векторы , приводимые в движение вируса саркомы Рауса (RSV) , промотор имел гораздо более высокие скорости экспрессии. Совсем недавно экспрессия и иммуногенность в модельных системах были дополнительно увеличены за счет использования немедленного раннего промотора цитомегаловируса (CMV) и ретровирусного цис-действующего транскрипционного элемента . Дополнительные модификации для повышения скорости экспрессии включают вставку энхансерных последовательностей, синтетических интронов , последовательностей трехчастного лидера аденовируса (TPL) и модификации последовательностей полиаденилирования и терминации транскрипции. Примером плазмиды ДНК-вакцины является pVAC, в которой используется промотор SV40 .

Явления структурной нестабильности вызывают особую озабоченность при производстве плазмид, ДНК-вакцинации и генной терапии. Дополнительные области, относящиеся к остову плазмиды, могут участвовать в широком диапазоне явлений структурной нестабильности. Хорошо известные катализаторы генетической нестабильности включают прямые, инвертированные и тандемные повторы, которые заметны во многих коммерчески доступных векторах клонирования и экспрессии. Следовательно, уменьшение или полное устранение посторонних некодирующих последовательностей основной цепи значительно снизило бы склонность к возникновению таких событий и, следовательно, рекомбиногенный потенциал плазмиды в целом.

Механизм плазмид

Как только плазмида вставляется в ядро ​​трансфицированной клетки, она кодирует пептидную цепочку чужеродного антигена. На своей поверхности клетка отображает чужеродный антиген с молекулами как класса I комплекса гистосовместимости (MHC), так и класса II. Затем антигенпредставляющая клетка перемещается к лимфатическим узлам и представляет антигенный пептид и костимулирующую молекулу, передающую сигнал Т-клетке, инициируя иммунный ответ.

Дизайн вкладыша вакцины

Иммуногены могут быть нацелены на различные клеточные компартменты для улучшения антител или цитотоксических Т-клеточных ответов. Секретируемые антигены или антигены, связанные с плазматической мембраной , более эффективны в индукции антител, чем цитозольные антигены, в то время как цитотоксические Т-клеточные ответы могут быть улучшены за счет нацеливания антигенов для цитоплазматической деградации и последующего вступления в путь класса I главного комплекса гистосовместимости (MHC). Обычно это достигается добавлением сигналов N-концевого убиквитина .

Конформации белка может также влиять на иммунные реакции. «Упорядоченные» структуры (такие как вирусные частицы) более эффективны, чем неупорядоченные структуры. Цепочки минигенов (или эпитопов MHC класса I ) от различных патогенов вызывают ответ цитотоксических Т-клеток на некоторые патогены, особенно если также включен TH-эпитоп.

Доставка

Методы ДНК-вакцины и генной терапии схожи.

ДНК-вакцины были введены в ткани животных несколькими способами. В 1999 году двумя наиболее популярными подходами были инъекции ДНК в физиологическом растворе : с помощью стандартной иглы для подкожных инъекций или с помощью доставки генного пистолета . За прошедшие годы было зарегистрировано несколько других методов.

Физиологический раствор

Инъекция в физиологическом растворе обычно проводится внутримышечно (IM) в скелетные мышцы или внутрикожно (ID), доставляя ДНК во внеклеточные пространства. Этому может способствовать либо 1) электропорация ; 2) путем временного повреждения мышечных волокон миотоксинами, такими как бупивакаин ; или 3) с использованием гипертонических растворов физиологического раствора или сахарозы . На иммунные реакции на этот метод могут влиять такие факторы, как тип иглы, положение иглы, скорость инъекции, объем инъекции, тип мышц, а также возраст, пол и физиологическое состояние реципиента.

Генная пушка

Доставка генной пушки баллистически ускоряет плазмидную ДНК (пДНК), которая была поглощена микрочастицами золота или вольфрама в клетках-мишенях, используя сжатый гелий в качестве ускорителя.

Доставка через слизистую оболочку

Альтернативы включали аэрозольную инстилляцию голой ДНК на поверхности слизистых оболочек , таких как слизистая оболочка носа и легких , а также местное введение пДНК в глаза и слизистую оболочку влагалища. Доставка на поверхность слизистой оболочки также достигается с использованием препаратов катионных липосом -ДНК, биоразлагаемых микросфер, аттенуированных векторов Salmonalla , Shigella или Listeria для перорального введения в слизистую оболочку кишечника и рекомбинантных аденовирусных векторов.

Полимерный носитель

Гибридный носитель, состоящий из бактериальных клеток и синтетических полимеров , был использован для доставки ДНК-вакцины. E.coli , внутреннее ядро и поли (бета-амино сложного эфира) внешнюю функцию пальто синергетически для повышения эффективности путем устранения барьеров , связанных с антиген-представляющих клеток доставки генов , которые включают в себя клеточное поглощение и интернализации, phagosomal побег и внутриклеточную концентрацию груза. При испытании на мышах было обнаружено, что гибридный вектор индуцирует иммунный ответ.

Иммунизация ELI

Другой подход к ДНК-вакцинации - иммунизация библиотеки экспрессии (ELI). Используя этот метод, потенциально все гены патогена могут быть доставлены одновременно, что может быть полезно для патогенов, которые трудно ослабить или культивировать. ELI можно использовать для определения того, какие гены вызывают защитный ответ. Это было протестировано с Mycoplasma pulmonis , патогеном легких мышей с относительно небольшим геномом . Даже библиотеки частичной экспрессии могут вызвать защиту от последующего заражения.

Полезное табличное сравнение

Дозировка

Метод доставки определяет дозу, необходимую для повышения эффективности иммунного ответа. Для инъекций физиологического раствора требуется различное количество ДНК, от 10 мкг до 1 мг, тогда как для доставки генной пушки требуется в 100–1000 раз меньше. Как правило, требуется от 0,2 до 20 мкг, хотя сообщалось о таких низких количествах, как 16 нг. Эти количества зависят от вида. Например, мышам требуется примерно в 10 раз меньше ДНК, чем приматам . Для инъекций физиологического раствора требуется больше ДНК, потому что ДНК доставляется во внеклеточные пространства целевой ткани (обычно мышцы), где ей приходится преодолевать физические барьеры (такие как базальная пластинка и большое количество соединительной ткани ), прежде чем она будет поглощена клетки, в то время как генная пушка доставляет ДНК непосредственно в клетки, что приводит к меньшим потерям.

Иммунная реакция

Ответы вспомогательных Т-клеток

Презентация антигена стимулирует Т-клетки становиться либо «цитотоксическими» клетками CD8 +, либо «вспомогательными» клетками CD4 +. Цитотоксические клетки напрямую атакуют другие клетки, несущие на своей поверхности определенные чужеродные или аномальные молекулы. Т-хелперы, или Th-клетки, координируют иммунные ответы, взаимодействуя с другими клетками. В большинстве случаев Т-клетки распознают антиген только в том случае, если он переносится на поверхность клетки одной из собственных молекул MHC организма или главного комплекса гистосовместимости.

ДНК - иммунизация может поднять несколько Т _H ответов, в том числе и лимфопролиферации генерации различных цитокинов профилей. Основным преимуществом ДНК-вакцин является легкость, с которой ими можно манипулировать для смещения типа помощи Т-клеток в сторону ответа TH1 или TH2. Каждый тип имеет отличительные паттерны экспрессии лимфокинов и хемокинов, специфические типы иммуноглобулинов , паттерны движения лимфоцитов и типы врожденных иммунных ответов .

Другие виды помощи Т-лимфоцитов

На тип получаемой помощи Т-клеток влияют способ доставки и тип экспрессируемого иммуногена, а также нацеливание на различные лимфоидные компартменты. Как правило, инъекции физиологического раствора (внутримышечно или внутримышечно) имеют тенденцию вызывать ответы TH1, в то время как доставка генной пушки повышает ответы TH2. Это верно для внутриклеточных антигенов и антигенов, связанных с плазматической мембраной, но не для секретируемых антигенов, которые, по-видимому, вызывают ответы TH2, независимо от метода доставки.

Как правило, тип получаемой помощи Т-лимфоцитами остается стабильным с течением времени и не меняется при заражении или после последующих иммунизаций, которые обычно вызывали бы противоположный тип ответа у наивных образцов. Однако Mor et al. . (1995) иммунизировали и бустировали мышей пДНК, кодирующей белок циркумспорозоит малярийного паразита мышей Plasmodium yoelii (PyCSP), и обнаружили, что первоначальный ответ TH2 изменился после бустинга на ответ TH1.

Основа для различных типов помощи Т-лимфоцитов

Неизвестно, как действуют эти различные методы, формы экспрессируемого антигена и различные профили помощи Т-лимфоцитов. Считалось, что относительно большие количества ДНК, используемые при внутримышечной инъекции, были ответственны за индукцию ответов TH1. Однако данные свидетельствуют об отсутствии дозозависимых различий по типу TH. Тип повышения помощи Т-клеток определяется дифференцированным состоянием антигенпрезентирующих клеток . Дендритные клетки могут дифференцироваться, чтобы секретировать IL-12 (который поддерживает развитие клеток TH1) или IL-4 (который поддерживает ответы TH2). ПДНК, вводимая иглой, эндоцитируется в дендритную клетку, которая затем стимулируется для дифференцировки для выработки цитокинов TH1 , в то время как генная пушка бомбардирует ДНК непосредственно в клетку, минуя стимуляцию TH1.

Практическое использование помощи поляризованных Т-клеток

Поляризация в Т-клетках помогает влиять на аллергические реакции и аутоиммунные заболевания . При аутоиммунных заболеваниях цель состоит в том, чтобы сместить саморазрушающий ответ TH1 (с связанной с ним цитотоксической активностью Т-клеток) на неразрушающий ответ TH2. Это было успешно применено в предварительном праймировании для желаемого типа ответа в доклинических моделях и в некоторой степени успешно смещает ответ для установленного заболевания.

Цитотоксические Т-клеточные ответы

Одно из преимуществ ДНК-вакцин состоит в том, что они способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) без риска, присущего живым вакцинам. Ответы CTL могут быть повышены против иммунодоминантных и иммунорецессивных эпитопов CTL, а также против субдоминантных эпитопов CTL способом, который, по-видимому, имитирует естественную инфекцию . Это может оказаться полезным инструментом для оценки эпитопов CTL и их роли в обеспечении иммунитета.

Цитотоксические Т-клетки распознают небольшие пептиды (8-10 аминокислот ) комплекс с МНС класса I молекул. Эти пептиды происходят из эндогенных цитозольных белков, которые расщепляются и доставляются в формирующуюся молекулу MHC класса I внутри эндоплазматического ретикулума (ER). Таким образом, нацеливание генных продуктов непосредственно на ER (путем добавления аминоконцевой инсерционной последовательности ) должно усиливать ответы CTL. Это было успешно продемонстрировано с использованием рекомбинантных вирусов осповакцины, экспрессирующих белки гриппа , но этот принцип также должен быть применим к ДНК-вакцинам. Было показано, что нацеливание на антигены для внутриклеточной деградации (и, таким образом, вступление в путь MHC класса I) путем добавления сигнальных последовательностей убиквитина или мутации других сигнальных последовательностей, эффективно для увеличения ответов CTL.

CTL-ответы могут быть усилены совместной инокуляцией костимулирующими молекулами, такими как B7-1 или B7-2 для ДНК-вакцин против нуклеопротеинов гриппа, или GM-CSF для ДНК-вакцин против мышиной модели малярии P. yoelii . Было показано, что совместная инокуляция плазмидами, кодирующими костимулирующие молекулы IL-12 и TCA3, увеличивает активность CTL в отношении нуклеопротеиновых антигенов ВИЧ-1 и гриппа.

Гуморальный (антительный) ответ

Схематическая диаграмма антитела и антигенов

На ответы антител, вызванные вакцинацией ДНК, влияют несколько переменных, включая тип антигена; расположение антигена (т.е. внутриклеточное или секретируемое); количество, частота и доза иммунизации; сайт и способ доставки антигена.

Кинетика ответа антител

Гуморальные ответы после однократной инъекции ДНК могут быть намного более продолжительными, чем после однократной инъекции рекомбинантного белка. Антительный ответ против белка оболочки вируса гепатита B (HBV) (HBsAg) сохранялся до 74 недель без бустерной стимуляции, в то время как у мышей было продемонстрировано пожизненное сохранение защитного ответа на гемагглютинин гриппа после доставки генной пушки. Клетки, секретирующие антитела, мигрируют в костный мозг и селезенку для длительного производства антител и обычно локализуются там через год.

Сравнения ответов антител, вызванных естественной (вирусной) инфекцией, иммунизацией рекомбинантным белком и иммунизацией пДНК, суммированы в таблице 4. Ответы антител, индуцированные ДНК, растут намного медленнее, чем при естественной инфекции или иммунизации рекомбинантным белком. Для достижения пиковых титров у мышей может потребоваться до 12 недель, хотя усиление может уменьшить интервал. Этот ответ, вероятно, происходит из-за низких уровней антигена, экспрессируемого в течение нескольких недель, что поддерживает как первичную, так и вторичную фазы ответа антител. ДНК-вакцина, экспрессирующая белок малой и средней оболочки HBV, вводилась взрослым с хроническим гепатитом. Вакцина привела к образованию специфических гамма-клеток интерферона. Также были разработаны специфические Т-клетки для антигенов белков средней оболочки. Иммунный ответ пациентов был недостаточно устойчивым, чтобы контролировать инфекцию HBV.

Кроме того, титры специфических антител, вызванные ДНК-вакцинацией, ниже, чем титры, полученные после вакцинации рекомбинантным белком. Однако антитела, индуцированные ДНК-иммунизацией, проявляют большее сродство к нативным эпитопам, чем антитела, индуцированные рекомбинантным белком. Другими словами, иммунизация ДНК вызывает качественно лучший ответ. Антитела могут быть индуцированы после одной вакцинации ДНК, тогда как вакцинация рекомбинантным белком обычно требует повторной вакцинации. ДНК-иммунизация может использоваться для искажения профиля TH иммунного ответа и, следовательно, изотипа антитела, что невозможно ни при естественной инфекции, ни при иммунизации рекомбинантным белком. Ответы антител, генерируемые ДНК, полезны в качестве препаративного инструмента. Например, поликлональные и моноклональные антитела могут быть созданы для использования в качестве реагентов.

Механистическая основа иммунных ответов, вызванных ДНК

Механизм захвата ДНК

Когда поглощение ДНК и последующая экспрессия были впервые продемонстрированы in vivo в мышечных клетках, эти клетки считались уникальными из-за их обширной сети Т-канальцев. С помощью электронной микроскопии было высказано предположение, что поглощению ДНК способствуют кавеолы (или ямки, не покрытые клатрином). Однако последующие исследования показали, что другие клетки (такие как кератиноциты , фибробласты и эпителиальные клетки Лангерганса ) также могут интернализовать ДНК. Механизм захвата ДНК неизвестен.

Преобладают две теории: поглощение ДНК in vivo происходит неспецифично, методом, аналогичным фаго, или пиноцитозу , или через специфические рецепторы. Они могут включать поверхностный рецептор 30 кДа или рецепторы-поглотители макрофагов . Поверхностный рецептор 30 кДа специфически связывается с фрагментами ДНК размером 4500 п.н. (которые затем интернализуются) и обнаруживается на профессиональных APC и Т-клетках. Рецепторы-поглотители макрофагов связываются с множеством макромолекул, включая полирибонуклеотиды, и, таким образом, являются кандидатами на поглощение ДНК. Рецептор-опосредованному захвату ДНК может способствовать присутствие полигуанилатных последовательностей . Системы доставки генного пистолета, упаковка катионных липосом и другие способы доставки обходят этот метод входа, но понимание его может быть полезно для снижения затрат (например, за счет снижения потребности в цитофектинах), что может быть важно в животноводстве.

Презентация антигена клетками костного мозга

Дендритная клетка.

Исследования с использованием химерных мышей показали, что антиген представлен клетками костного мозга, которые включают дендритные клетки, макрофаги и специализированные B-клетки, называемые профессиональными антигенпредставляющими клетками (APC). После инокуляции генной пушки на кожу трансфицированные клетки Лангерганса мигрируют в дренирующий лимфатический узел, чтобы представить антигены. После внутримышечных и внутримышечных инъекций дендритные клетки представляют антиген в дренирующем лимфатическом узле, а трансфицированные макрофаги обнаруживаются в периферической крови.

Помимо прямой трансфекции дендритных клеток или макрофагов, после доставки IM, ID и ДНК генной пушки происходит перекрестное праймирование. Перекрестный прайминг происходит, когда клетка, полученная из костного мозга, представляет пептиды из белков, синтезированных в другой клетке в контексте MHC класса 1. Это может инициировать цитотоксические Т-клеточные ответы и, по-видимому, важно для полного первичного иммунного ответа.

Роль целевого сайта

Доставка ДНК с помощью IM и ID инициирует иммунные ответы по-разному. В коже кератиноциты, фибробласты и клетки Лангерганса захватывают и экспрессируют антигены и отвечают за индукцию первичного ответа антител. Трансфицированные клетки Лангерганса мигрируют из кожи (в течение 12 часов) в дренирующий лимфатический узел, где вызывают вторичные В- и Т-клеточные реакции. В скелетных мышцах клетки поперечно-полосатых мышц наиболее часто трансфицируются, но, по-видимому, не имеют значения для иммунного ответа. Вместо этого ДНК, инокулированная внутримышечно, «смывается» в дренирующий лимфатический узел в течение нескольких минут, где дистальные дендритные клетки трансфицируются и затем инициируют иммунный ответ. Трансфицированные миоциты, по-видимому, действуют как «резервуар» антигена для торговли профессиональными APC.

Поддержание иммунного ответа

ДНК-вакцинация генерирует эффективную иммунную память за счет отображения комплексов антиген-антитело на фолликулярных дендритных клетках (FDC), которые являются мощными стимуляторами B-клеток. Т-клетки могут стимулироваться аналогичными дендритными клетками зародышевого центра. FDC способны генерировать иммунную память, поскольку выработка антител «перекрывает» долгосрочную экспрессию антигена, позволяя иммунокомплексам антиген-антитело формироваться и отображаться с помощью FDC.

Интерфероны

Как хелперные, так и цитотоксические Т-клетки могут контролировать вирусные инфекции, секретируя интерфероны. Цитотоксические Т-клетки обычно убивают инфицированные вирусом клетки. Однако их также можно стимулировать к секреции противовирусных цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α , которые не убивают клетку, но ограничивают вирусную инфекцию путем подавления экспрессии вирусных компонентов. ДНК-вакцинация может использоваться для сдерживания вирусных инфекций с помощью неразрушающего контроля, опосредованного IFN. Это было продемонстрировано для гепатита B. IFN-γ имеет решающее значение для борьбы с малярийными инфекциями и является важным фактором при разработке противомалярийных ДНК-вакцин.

Модуляция иммунного ответа

Модуляция цитокинов

Эффективная вакцина должна вызывать соответствующий иммунный ответ на данный патоген. ДНК-вакцины могут поляризовать помощь Т-клеток в сторону профилей TH1 или TH2 и при необходимости генерировать CTL и / или антитела. Это может быть достигнуто путем модификации формы экспрессируемого антигена (т.е. внутриклеточный по сравнению с секретируемым), метода и пути доставки или дозы. Это также может быть выполнено путем совместного введения плазмидной ДНК, кодирующей иммунные регуляторные молекулы, то есть цитокины, лимфокины или костимуляторные молекулы. Эти «генетические адъюванты » можно вводить в виде:

• смесь 2 плазмид, одна кодирует иммуноген, а другая - цитокин
• одиночный би- или полицистронный вектор, разделенный спейсерами
• кодируемая плазмидой химера или слитый белок

В целом, совместное введение провоспалительных агентов (таких как различные интерлейкины , фактор некроза опухоли и GM-CSF) плюс TH2-индуцирующие цитокины увеличивают ответ антител, тогда как провоспалительные агенты и TH1-индуцирующие цитокины снижают гуморальные ответы и повышают цитотоксические ответы (более важны для защиты от вирусов). Иногда используются костимулирующие молекулы, такие как B7-1 , B7-2 и CD40L .

Эта концепция была применена при местном введении пДНК, кодирующей IL-10 . Плазмида, кодирующая B7-1 (лиганд APC), успешно усиливала иммунный ответ на моделях опухолей. Смешивание плазмид, кодирующих GM-CSF и циркумспорозоитный белок P. yoelii (PyCSP), усиливало защиту от последующего заражения (тогда как один PyCSP, кодируемый плазмидой, этого не делал). Было высказано предположение, что GM-CSF заставляет дендритные клетки более эффективно презентировать антиген и увеличивать продукцию IL-2 и активацию TH-клеток, тем самым стимулируя усиленный иммунный ответ. Это может быть дополнительно усилено первым примированием смесью pPyCSP и pGM-CSF с последующим усилением рекомбинантным поксвирусом, экспрессирующим PyCSP. Однако совместная инъекция плазмид, кодирующих GM-CSF (или IFN-γ, или IL-2) и гибридный белок поверхностного белка 1 мерозоита P. chabaudi (C-конец) -поверхностный белок вируса гепатита B (PcMSP1-HBs) отменяет защиту от заражения по сравнению с защитой, полученной путем доставки только pPcMSP1-HBs.

Преимуществами генетических адъювантов являются их низкая стоимость и простота введения, а также предотвращение нестабильных рекомбинантных цитокинов и потенциально токсичных «обычных» адъювантов (таких как квасцы , фосфат кальция , монофосфориллипид А, холерный токсин, катионные липосомы и липосомы, покрытые маннаном. , QS21 , карбоксиметилцеллюлоза и убенимикс ). Однако потенциальная токсичность пролонгированной экспрессии цитокинов не установлена. У многих коммерчески важных видов животных гены цитокинов не идентифицированы и не изолированы. Кроме того, различные цитокины, кодируемые плазмидами, по-разному модулируют иммунную систему в зависимости от времени доставки. Например, некоторые цитокиновые плазмидные ДНК лучше всего доставляются после иммуногенной пДНК, поскольку пре- или совместная доставка может снижать специфические ответы и увеличивать неспецифические ответы.

Иммуностимулирующие мотивы CpG

Сама плазмидная ДНК, по-видимому, оказывает адъювантное действие на иммунную систему. ДНК, полученная из бактерий, может запускать механизмы врожденной иммунной защиты, активацию дендритных клеток и выработку цитокинов TH1. Это связано с распознаванием определенных иммуностимулирующих последовательностей динуклеотидов CpG. Последовательности, стимулирующие CpG (CpG-S), встречаются в ДНК бактериального происхождения в двадцать раз чаще, чем у эукариот. Это связано с тем, что эукариоты демонстрируют «подавление CpG», т. Е. Динуклеотидные пары CpG встречаются гораздо реже, чем ожидалось. Кроме того, последовательности CpG-S гипометилированы. Это часто происходит в бактериальной ДНК, тогда как мотивы CpG, встречающиеся у эукариот, метилированы по нуклеотиду цитозина. Напротив, нуклеотидные последовательности, которые ингибируют активацию иммунного ответа (называемого нейтрализующим CpG или CpG-N), чрезмерно представлены в геномах эукариот. Оптимальная иммуностимулирующая последовательность представляет собой неметилированный динуклеотид CpG, фланкированный двумя 5'- пуринами и двумя 3'- пиримидинами . Кроме того, фланкирующие области за пределами этого иммуностимулирующего гексамера должны быть богаты гуанином, чтобы гарантировать связывание и захват клетками-мишенями.

Врожденная система работает с адаптивной иммунной системой, чтобы вызвать ответ против белка, кодируемого ДНК. Последовательности CpG-S индуцируют активацию поликлональных В-клеток и усиление экспрессии и секреции цитокинов. Стимулированные макрофаги секретируют IL-12, IL-18 , TNF-α, IFN-α, IFN-β и IFN-γ, тогда как стимулированные B-клетки секретируют IL-6 и некоторое количество IL-12.

Манипуляции с последовательностями CpG-S и CpG-N в плазмидном скелете ДНК-вакцин могут гарантировать успех иммунного ответа на кодируемый антиген и стимулировать иммунный ответ к фенотипу TH1. Это полезно, если патоген требует ответа TH для защиты. Последовательности CpG-S также использовались в качестве внешних адъювантов как для ДНК-вакцинации, так и для вакцинации рекомбинантным белком с различными показателями успеха. Другие организмы с гипометилированными мотивами CpG продемонстрировали стимуляцию поликлональной экспансии B-клеток. Механизм этого может быть более сложным, чем простое метилирование - гипометилированная ДНК мыши не вызывает иммунного ответа.

Большинство доказательств иммуностимулирующих последовательностей CpG получено в исследованиях на мышах. Экстраполяция этих данных на другие виды требует осторожности - отдельные виды могут нуждаться в разных фланкирующих последовательностях, поскольку специфичность связывания рецепторов скавенджеров различается у разных видов. Кроме того, такие виды, как жвачные животные, могут быть нечувствительны к иммуностимулирующим последовательностям из-за большой нагрузки на желудочно-кишечный тракт.

Альтернативные бусты

Иммунные ответы, примированные ДНК, можно усилить введением рекомбинантного белка или рекомбинантных поксвирусов. Стратегии «прайм-буста» с рекомбинантным белком успешно увеличили как титр нейтрализующих антител, так и авидность и устойчивость антител для слабых иммуногенов, таких как белок оболочки ВИЧ-1. Было показано, что усиление рекомбинантного вируса очень эффективно при усилении ответов ЦТЛ, примированных ДНК. Примирование ДНК направляет иммунный ответ на требуемый иммуноген, тогда как усиление рекомбинантным вирусом обеспечивает большее количество экспрессированного антигена, что приводит к значительному усилению специфических ответов CTL.

В ряде исследований стратегии прайм-буста были успешными в обеспечении защиты от заражения малярией. Примированные мыши с плазмидной ДНК, кодирующей поверхностный белок циркумспорозоита Plasmodium yoelii (PyCSP), затем усиленные рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим тот же белок, имели значительно более высокие уровни антител, активности CTL и IFN-γ и, следовательно, более высокие уровни защиты, чем иммунизированные мыши и усилен только плазмидной ДНК. Это может быть дополнительно усилено путем праймирования смесью плазмид, кодирующих PyCSP и мышиный GM-CSF, перед бустингом рекомбинантным вирусом осповакцины. Также была продемонстрирована эффективная стратегия первичного повышения для обезьяньей малярийной модели P. knowlesi . Макак-резус примировали многокомпонентной многоступенчатой ​​ДНК-вакциной, кодирующей два антигена стадии печени - поверхностный белок циркумспорозоит (PkCSP) и поверхностный белок спорозоит 2 (PkSSP2) - и два антигена стадии крови - апикальный поверхностный белок мерозоитов 1 (PkAMA1) и поверхностный белок 1 мерозоитов (PkMSP1p42). Затем они были усилены рекомбинантным вирусом оспы канареек, кодирующим все четыре антигена (ALVAC-4). Иммунизированные обезьяны выработали антитела против спорозоитов и инфицированных эритроцитов, а также Т-клеточные ответы, секретирующие IFN-γ, против пептидов из PkCSP. Была достигнута частичная защита от заражения спорозоитом, и средняя паразитемия была значительно снижена по сравнению с контрольными обезьянами. Эти модели, хотя и не идеальны для экстраполяции на P. falciparum у людей, будут важны в доклинических испытаниях.

Повышение иммунного ответа

ДНК

Эффективность иммунизации ДНК можно повысить за счет стабилизации ДНК от деградации и увеличения эффективности доставки ДНК в антигенпрезентирующие клетки . Это было продемонстрировано путем покрытия биоразлагаемых катионных микрочастиц (таких как сополимер лактида с гликолидом) с цетилтриметиламмонийбромидом ) ДНК. Такие покрытые ДНК микрочастицы могут быть столь же эффективными в повышении уровня CTL, как и рекомбинантные вирусы, особенно при смешивании с квасцами. Частицы диаметром 300 нм оказываются наиболее эффективными для поглощения антигенпрезентирующими клетками.

Альфавирусные векторы

Векторы на основе рекомбинантных альфавирусов были использованы для повышения эффективности вакцинации ДНК. Ген, кодирующий интересующий антиген, вставляется в репликон альфавируса, заменяя структурные гены, но оставляя неструктурные гены репликазы нетронутыми. Вирус Синдбиса и вирус Semliki Forest были использованы для создания рекомбинантных альфавирусных репликонов . В отличие от обычных вакцинаций ДНК, альфавирусные векторы убивают трансфицированные клетки и экспрессируются только временно. Гены репликазы альфавируса экспрессируются в дополнение к вакцинной вставке. Неясно, как репликоны альфавируса вызывают иммунный ответ, но это может быть связано с высокими уровнями белка, экспрессируемого этим вектором, ответами цитокинов, индуцированными репликонами, или индуцированным репликонами апоптозом, приводящим к усиленному захвату антигена дендритными клетками.

Смотрите также

• Векторная ДНК
• Вакцина против ВИЧ
• Генная терапия
• РНК-вакцина

использованная литература

дальнейшее чтение

У Схолии есть профиль на ДНК-вакцину (Q578537) .