Секвенатор ДНК - DNA sequencer

Секвенатор ДНК

Секвенаторы ДНК
Производители	Roche , Illumina , Life Technologies , Beckman Coulter , Pacific Biosciences , MGI / BGI , Oxford Nanopore Technologies

Секвенатор ДНК - это научный инструмент, используемый для автоматизации процесса секвенирования ДНК . Принимая во внимание образец ДНК , секвенсор ДНК используется для определения порядка четырех оснований: G ( гуанин ), С ( цитозин ), А ( аденин ), Т ( тимин ). Затем это отображается в виде текстовой строки , называемой чтением. Некоторые секвенаторы ДНК также можно рассматривать как оптические инструменты, поскольку они анализируют световые сигналы, исходящие от флуорохромов, прикрепленных к нуклеотидам .

Первый автоматический секвенатор ДНК, изобретенный Ллойдом М. Смитом , был представлен Applied Biosystems в 1987 году. Он использовал метод секвенирования по Сэнгеру , технологию, которая легла в основу «первого поколения» секвенаторов ДНК и позволила завершить разработку человеческого генома в 2001 году. Это первое поколение секвенаторов ДНК - это, по сути, автоматизированные системы электрофореза , которые обнаруживают миграцию меченых фрагментов ДНК. Следовательно, эти секвенаторы также можно использовать при генотипировании генетических маркеров, когда необходимо определять только длину фрагмента (ов) ДНК (например, микросателлиты , AFLP ).

Проект « Геном человека» стимулировал разработку более дешевых, высокопроизводительных и точных платформ, известных как секвенаторы нового поколения (NGS), для секвенирования генома человека . К ним относятся платформы секвенирования ДНК 454, SOLiD и Illumina . Машины секвенирования нового поколения существенно увеличили скорость секвенирования ДНК по сравнению с предыдущими методами Сэнгера. Образцы ДНК можно приготовить автоматически всего за 90 минут, а геном человека можно секвенировать с 15-кратным охватом всего за несколько дней.

Более поздние секвенаторы третьего поколения, такие как SMRT и Oxford Nanopore, измеряют добавление нуклеотидов к одной молекуле ДНК в режиме реального времени.

Из-за ограничений технологии секвенатора ДНК эти чтения короткие по сравнению с длиной генома, поэтому чтения должны быть собраны в более длинные контиги . Данные также могут содержать ошибки, вызванные ограничениями в методике секвенирования ДНК или ошибками во время амплификации ПЦР . Производители секвенаторов ДНК используют ряд различных методов для определения присутствующих оснований ДНК. Конкретные протоколы, применяемые на разных платформах секвенирования, влияют на генерируемые окончательные данные. Поэтому сравнение качества и стоимости данных по разным технологиям может оказаться непростой задачей. Каждый производитель предоставляет свои собственные способы информирования об ошибках секвенирования и баллах. Однако ошибки и оценки между разными платформами не всегда можно напрямую сравнивать. Поскольку в этих системах используются различные подходы к секвенированию ДНК, выбор лучшего секвенатора и метода ДНК обычно зависит от целей эксперимента и доступного бюджета.

История

Первые методы секвенирования ДНК были разработаны Гилбертом (1973) и Сэнгером (1975). Гилберт представил метод секвенирования, основанный на химической модификации ДНК с последующим расщеплением по определенным основаниям, тогда как метод Сэнгера основан на терминации дидезоксинуклеотидной цепи. Метод Сэнгера стал популярным благодаря своей повышенной эффективности и низкой радиоактивности. Первым автоматическим секвенатором ДНК был AB370A, представленный в 1986 году компанией Applied Biosystems . AB370A был способен секвенировать 96 образцов одновременно, 500 килобаз в день и достигая длины считывания до 600 оснований. Это было началом «первого поколения» секвенаторов ДНК, в которых реализовано секвенирование по Сэнгеру, флуоресцентные дидезоксинуклеотиды и полиакриламидный гель, помещенный между стеклянными пластинами - пластинчатыми гелями. Следующим крупным достижением стал выпуск в 1995 году AB310, в котором для разделения цепей ДНК с помощью электрофореза использовался линейный полимер в капилляре вместо пластинчатого геля. Эти методы легли в основу завершения проекта генома человека в 2001 году. Проект генома человека стимулировал разработку более дешевых, высокопроизводительных и точных платформ, известных как секвенсоры нового поколения (NGS). В 2005 году компания 454 Life Sciences выпустила секвенатор 454, за которым последовали анализатор генома Solexa и SOLiD (поддерживаемое обнаружение лигирования олигонуклеотидов) от Agencourt в 2006 году. Applied Biosystems приобрела Agencourt в 2006 году, а в 2007 году Roche купила 454 Life Sciences, а Illumina приобрела Solexa. . Ion Torrent вышел на рынок в 2010 году и был приобретен компанией Life Technologies (ныне Thermo Fisher Scientific). И BGI начала производство секвенсоров в Китае после приобретения Complete Genomics под своим крылом MGI . Это все еще самые распространенные системы NGS из-за их конкурентоспособной стоимости, точности и производительности.

Совсем недавно было представлено третье поколение секвенаторов ДНК. Методы секвенирования, применяемые этими секвенаторами, не требуют амплификации ДНК (полимеразная цепная реакция - ПЦР), что ускоряет подготовку образца перед секвенированием и снижает количество ошибок. Кроме того, данные секвенирования собираются из реакций, вызванных добавлением нуклеотидов в комплементарной цепи в режиме реального времени. Две компании представили разные подходы в своих секвенаторах третьего поколения. Секвенсоры Pacific Biosciences используют метод, называемый одномолекулярным в реальном времени (SMRT), где данные секвенирования производятся с помощью света (захваченного камерой), излучаемого при добавлении нуклеотида к комплементарной цепи ферментами, содержащими флуоресцентные красители. Oxford Nanopore Technologies - еще одна компания, разрабатывающая секвенаторы третьего поколения с использованием электронных систем, основанных на технологиях обнаружения нанопор.

Производители секвенаторов ДНК

Секвенсоры ДНК были разработаны, изготовлены и проданы, в частности, следующими компаниями.

Рош

Секвенатор ДНК 454 стал первым коммерчески успешным секвенатором нового поколения. Он был разработан 454 Life Sciences и приобретен компанией Roche в 2007 году. 454 использует обнаружение пирофосфата, высвобождаемого в результате реакции ДНК-полимеразы, при добавлении нуклеотида к матричному штамму.

В настоящее время Roche производит две системы на основе своей технологии пиросеквенирования: GS FLX + и GS Junior System. Система GS FLX + обещает длину считывания приблизительно 1000 пар оснований, в то время как система GS Junior обещает считывание 400 пар оснований. Предшественник GS FLX +, система 454 GS FLX Titanium была выпущена в 2008 году, обеспечивая выход 0,7 ГБ данных за цикл, с точностью 99,9% после качественного фильтра и длиной считывания до 700 бит / с. В 2009 году компания Roche выпустила GS Junior, настольную версию секвенсора 454 с длиной считывания до 400 пар оснований и упрощенной подготовкой библиотеки и обработкой данных.

Одним из преимуществ систем 454 является их скорость работы. Рабочие ресурсы могут быть сокращены за счет автоматизации подготовки библиотеки и полуавтоматизации эмульсионной ПЦР. Недостатком системы 454 является то, что она подвержена ошибкам при оценке количества оснований в длинной цепочке идентичных нуклеотидов. Это называется ошибкой гомополимера и возникает, когда в ряду 6 или более одинаковых оснований. Другой недостаток заключается в том, что цена на реагенты относительно выше по сравнению с другими секвенаторами следующего поколения.

В 2013 году компания Roche объявила, что прекратит разработку 454 технологий и полностью выведет из эксплуатации 454 машины в 2016 году.

Рош производит ряд программных инструментов, оптимизированных для анализа 454 данных секвенирования. GS Run Processor преобразует необработанные изображения, созданные в процессе секвенирования, в значения интенсивности. Процесс состоит из двух основных этапов: обработки изображения и обработки сигнала. Программное обеспечение также применяет нормализацию, коррекцию сигнала, базовый вызов и оценки качества для отдельных считываний. Программное обеспечение выводит данные в файлах стандартного формата блок-схемы (или SFF) для использования в приложениях анализа данных (GS De Novo Assembler, GS Reference Mapper или GS Amplicon Variant Analyzer). GS De Novo Assembler - это инструмент для сборки de novo полных геномов размером до 3 ГБ на основе одного считывания с дробовиком или в сочетании с парными конечными данными, сгенерированными 454 секвенсорами. Он также поддерживает сборку транскриптов de novo (включая анализ), а также обнаружение вариантов изоформы. GS Reference Mapper сопоставляет короткие чтения с эталонным геномом, генерируя согласованную последовательность. Программное обеспечение может генерировать выходные файлы для оценки с указанием вставок, удалений и SNP. Может обрабатывать большие и сложные геномы любого размера. Наконец, анализатор вариантов GS Amplicon сравнивает показания образцов ампликона с эталоном, идентифицируя варианты (связанные или нет) и их частоту. Его также можно использовать для обнаружения неизвестных и низкочастотных вариантов. Он включает графические инструменты для анализа трасс.

Иллюмина

Секвенатор Illumina Genome Analyzer II

Illumina производит ряд машин для секвенирования следующего поколения с использованием технологий, приобретенных у Manteia Predictive Medicine и разработанных Solexa. Illumina производит ряд секвенирующих машин следующего поколения, использующих эту технологию, включая HiSeq, Genome Analyzer IIx, MiSeq и HiScanSQ, которые также могут обрабатывать микрочипы .

Технология, ведущая к этим секвенаторам ДНК, была впервые выпущена компанией Solexa в 2006 году как анализатор генома. Illumina приобрела Solexa в 2007 году. В анализаторе генома используется метод секвенирования путем синтеза. Первая модель производила 1 Гб за пробег. В течение 2009 года объем производства был увеличен с 20 Гбайт в августе до 50 Гбайт в декабре. В 2010 году Illumina выпустила HiSeq 2000 с выходной мощностью 200, а затем 600 Гбайт на цикл, что заняло бы 8 дней. На момент своего выпуска HiSeq 2000 предоставлял одну из самых дешевых платформ для секвенирования по цене 0,02 доллара за миллион оснований по оценке Пекинского института геномики .

В 2011 году Illumina выпустила настольный секвенсор под названием MiSeq. На момент выпуска MiSeq мог генерировать 1,5 Гб за прогон с парными чтениями в конце 150 бит / с. Цикл секвенирования может быть выполнен за 10 часов при использовании автоматической подготовки образцов ДНК.

Illumina HiSeq использует два программных инструмента для расчета количества и положения кластеров ДНК для оценки качества секвенирования: систему управления HiSeq и анализатор в реальном времени. Эти методы помогают оценить, мешают ли соседние скопления друг другу.

Технологии Жизни

Life Technologies (теперь Thermo Fisher Scientific) производит секвенаторы ДНК под брендами Applied Biosystems и Ion Torrent . Applied Biosystems создает платформу для секвенирования нового поколения SOLiD и секвенаторы ДНК на основе Сэнгера, такие как генетический анализатор 3500. Под брендом Ion Torrent компания Applied Biosystems производит четыре секвенсора следующего поколения: систему Ion PGM, систему Ion Proton, систему Ion S5 и Ion S5xl. Предполагается, что компания также разрабатывает свой новый секвенатор капиллярной ДНК под названием SeqStudio, который будет выпущен в начале 2018 года.

Системы SOLiD были приобретены Applied Biosystems в 2006 году. SOLiD применяет секвенирование путем лигирования и двухосновного кодирования . Первая система SOLiD была запущена в 2007 году и обеспечивала считывание данных длиной 35 бит и 3G за один прогон. После пяти обновлений в 2010 году была выпущена система секвенирования 5500xl, значительно увеличившая длину считывания до 85 бит / с, повышая точность до 99,99% и производя 30 ГБ за 7-дневный прогон.

Ограниченная длина считывания SOLiD остается существенным недостатком и в некоторой степени ограничивает его использование в экспериментах, где длина считывания менее важна, таких как повторное секвенирование и анализ транскриптома, а также недавние эксперименты с ChIP-Seq и метилированием. Время подготовки образцов ДНК для систем SOLiD стало намного быстрее благодаря автоматизации подготовки библиотек секвенирования, такой как система Tecan.

Данные цветового пространства, созданные платформой SOLiD, могут быть декодированы в основы ДНК для дальнейшего анализа, однако программное обеспечение, которое учитывает исходную информацию о цветовом пространстве, может дать более точные результаты. Life Technologies выпустила BioScope, пакет анализа данных для повторного секвенирования, ChiP-Seq и анализа транскриптомов. Он использует алгоритм MaxMapper для сопоставления считываемых значений цветового пространства.

Бекман Коултер

Компания Beckman Coulter (ныне Danaher ) ранее производила секвенаторы ДНК на основе терминации цепи и капиллярного электрофореза под названием CEQ, включая CEQ 8000. В настоящее время компания производит систему генетического анализа GeXP, в которой используется секвенирование терминатора красителя . Этот метод использует термоциклер почти так же, как ПЦР, для денатурирования, отжига и удлинения фрагментов ДНК, амплификации секвенированных фрагментов.

Тихоокеанские биологические науки

Pacific Biosciences производит системы секвенирования PacBio RS и Sequel, используя метод секвенирования одной молекулы в реальном времени или SMRT. Эта система может производить считанные длины в несколько тысяч пар оснований. Более высокие необработанные ошибки чтения исправляются либо с использованием кругового консенсуса, когда одна и та же цепочка читается снова и снова, либо с использованием оптимизированных стратегий сборки . Ученые сообщили о точности 99,9999% этих стратегий. Система Sequel была запущена в 2015 году с увеличенной емкостью и более низкой ценой.

Секвенсор Oxford Nanopore MinION (внизу справа) использовался астронавтом Кэтлин Рубинс в первом в истории космосе секвенировании ДНК в августе 2016 года .

Оксфорд Нанопор

Oxford Nanopore Technologies начала поставки ранних версий своего секвенатора MinION для секвенирования нанопор в избранные лаборатории. Устройство имеет длину четыре дюйма и питается от порта USB . MinION декодирует ДНК напрямую, поскольку молекула протягивается со скоростью 450 оснований в секунду через нанопоры, взвешенные в мембране. Изменения электрического тока показывают, какая база присутствует. Его точность составляет от 60 до 85 процентов по сравнению с 99,9 процентами в обычных машинах. Даже неточные результаты могут оказаться полезными, потому что это приводит к большой длине чтения. GridION - это немного больший секвенсор, который обрабатывает до пяти проточных ячеек MinION одновременно. PromethION - еще один (неизданный) продукт, который будет использовать до 100000 пор параллельно, что больше подходит для секвенирования большого объема.

Сравнение

Текущие предложения в области технологии секвенирования ДНК показывают доминирующего игрока: Illumina (декабрь 2019 г.), за которым следуют PacBio , MGI / BGI и Oxford Nanopore .

использованная литература