Целлюлаза - Cellulase

Целлюлаза
Фермент целлюлаза, продуцируемый Thermomonospora fusca , с целлотриозой, связанной в мелкой бороздке каталитического домена.
Идентификаторы
ЕС нет.	3.2.1.4
№ CAS	9012-54-8
Базы данных
IntEnz	Просмотр IntEnz
BRENDA	BRENDA запись
ExPASy	Просмотр NiceZyme
КЕГГ	Запись в KEGG
MetaCyc	метаболический путь
ПРИАМ	профиль
Структуры PDB	RCSB PDB PDBe PDBsum
Генная онтология	Amigo / QuickGO
Поиск ЧВК статьи PubMed статьи NCBI белки

Ленточное изображение каталитического домена бета-1,4-эндоглюканазы Streptomyces lividans - пример из семейства 12 гликозидгидролаз

Целлюлаза - это любой из нескольких ферментов, вырабатываемых в основном грибами , бактериями и простейшими, которые катализируют целлюлолиз , разложение целлюлозы и некоторых родственных полисахаридов . Это название также используется для любой встречающейся в природе смеси или комплекса различных таких ферментов, которые действуют последовательно или синергетически, разлагая целлюлозный материал.

Целлюлазы расщепляют молекулу целлюлозы на моносахариды («простые сахара»), такие как бета- глюкоза , или более короткие полисахариды и олигосахариды . Распад целлюлозы имеет большое экономическое значение, поскольку делает основной компонент растений доступным для потребления и использования в химических реакциях. Конкретная вовлеченная реакция - это гидролиз 1,4- бета-D- гликозидных связей в целлюлозе, гемицеллюлозе , лихенине и бета-D- глюканах злаков . Поскольку молекулы целлюлозы прочно связываются друг с другом, целлюлолиз относительно труден по сравнению с распадом других полисахаридов, таких как крахмал.

Большинство млекопитающих имеют очень ограниченную способность переваривать пищевые волокна, такие как целлюлоза, сами по себе. У многих травоядных животных, таких как жвачные, такие как крупный рогатый скот и овцы, и у ферментеров задней кишки, таких как лошади, целлюлазы продуцируются симбиотическими бактериями. Эндогенные целлюлазы вырабатываются несколькими типами многоклеточных животных, такими как термиты , улитки и дождевые черви .

Недавно целлюлазы были также обнаружены в зеленых микроводорослях ( Chlamydomonas reinhardtii , Gonium pectorale и Volvox carteri ), и их каталитические домены (CD), принадлежащие к семейству GH9, демонстрируют наивысшую гомологию последовательностей с эндогенными целлюлазами многоклеточных животных . Целлюлазы водорослей являются модульными, состоящими из предполагаемых новых богатых цистеином углеводсвязывающих модулей (CBM), богатых пролином / серином (PS) линкеров в дополнение к предполагаемым Ig-подобным и неизвестным доменам в некоторых членах. Целлюлаза из Gonium pectorale состояла из двух CD, разделенных линкерами, и с C-концевой CBM.

Известно несколько различных видов целлюлаз, которые различаются структурно и механически. Синонимы, производные и специфические ферменты, связанные с названием «целлюлаза», включают эндо-1,4-бета-D-глюканазу (бета-1,4-глюканаза, бета-1,4-эндоглюкан гидролаза, эндоглюканаза D, 1,4 - (1,3,1,4) -бета-D-глюкан-4-глюканогидролаза), карбоксиметилцеллюлаза (CMCase), авицелаза, целлюдекстриназа , целлюлаза A , целлюлозин AP , щелочная целлюлаза , целлюлаза A 3 , целлюлаза 9,5 и панцеллаза SS . Ферменты, расщепляющие лигнин , иногда называли целлюлазами, но это старое использование не рекомендуется; они являются ферментами, модифицирующими лигнин .

Виды и действие

Пять основных типов целлюлаз в зависимости от типа катализируемой реакции:

• Эндоцеллюлазы (EC 3.2.1.4) случайным образом расщепляют внутренние связи в аморфных сайтах, которые создают новые концы цепи.
• Экзоцеллюлазы или целлобиогидролазы (EC 3.2.1.91) отщепляют от двух до четырех единиц на концах открытых цепей, продуцируемых эндоцеллюлазой, что приводит к тетрасахаридам или дисахаридам , таким как целлобиоза . Экзоцеллюлазы далее подразделяются на тип I, который действует процессивно с восстанавливающего конца цепи целлюлозы, и тип II, который действует процессивно с невосстанавливающего конца.
• Целлобиазы (EC 3.2.1.21) или бета-глюкозидазы гидролизуют продукт экзоцеллюлазы до индивидуальных моносахаридов.
• Окислительные целлюлазы деполимеризуют целлюлозу посредством радикальных реакций, как, например, целлобиозодегидрогеназа (акцептор) .
• Фосфорилазы целлюлозы деполимеризуют целлюлозу с использованием фосфатов вместо воды.

Авицелаза обладает почти исключительно экзоцеллюлазной активностью, поскольку авицелза представляет собой субстрат с высокой микрокристаллической структурой.

Среди вышеперечисленных типов есть также прогрессивные (также известные как процессивные) и непрогрессивные типы. Прогрессивная целлюлаза будет продолжать взаимодействовать с одной полисахаридной цепью, непрогрессивная целлюлаза будет взаимодействовать один раз, а затем отсоединиться и задействовать другую полисахаридную цепочку.

Действие целлюлазы считается синергическим, поскольку все три класса целлюлазы могут давать гораздо больше сахара, чем добавление всех трех по отдельности. Помимо жвачных, большинство животных (включая людей) не производят целлюлазу в своем организме и могут лишь частично расщеплять целлюлозу путем ферментации, что ограничивает их способность использовать энергию в волокнистом растительном материале.

Состав

Большинство грибковых целлюлаз имеют двухдоменную структуру с одним каталитическим доменом и одним целлюлозосвязывающим доменом, которые соединены гибким линкером. Эта структура адаптирована для работы с нерастворимым субстратом и позволяет ферменту двумерно диффундировать по поверхности, как гусеница. Однако есть также целлюлазы (в основном эндоглюканазы), в которых отсутствуют целлюлозосвязывающие домены.

Как связывание субстратов, так и катализ зависят от трехмерной структуры фермента, которая возникает как следствие уровня сворачивания белка . Аминокислотная последовательность и расположение их остатков, которые встречаются в активном центре, положение, в котором связывается субстрат, могут влиять на такие факторы, как сродство связывания лигандов, стабилизация субстратов в активном центре и катализ. Структура субстрата дополняет точную структуру активного центра фермента. Изменения положения остатков могут привести к нарушению одного или нескольких из этих взаимодействий. Дополнительные факторы, такие как температура, pH и ионы металлов, влияют на нековалентные взаимодействия между структурой ферментов. Виды Thermotoga maritima образуют целлюлазы, состоящие из 2 бета-листов (белковых структур), окружающих центральную каталитическую область, которая является активным центром. Фермент классифицируется как эндоглюканаза, которая внутренне расщепляет β-1,4-гликозидные связи в цепях целлюлозы, облегчая дальнейшее разложение полимера. Различные виды из того же семейства, что и T. Maritima, образуют целлюлазы с разной структурой. Целлюлазы, продуцируемые видом Coprinopsis Cinerea, состоят из семи белковых цепей в форме закрытого туннеля, называемого бета / альфа-стволом. Эти ферменты гидролизуют субстрат карбоксиметилцеллюлозу. Связывание субстрата в активном центре вызывает изменение конформации, что делает возможной деградацию молекулы.

Целлюлазные комплексы

У многих бактерий целлюлазы in vivo представляют собой сложные ферментные структуры, организованные в супрамолекулярные комплексы , целлюлосомы . Они могут содержать, но не ограничиваются ими, пять различных ферментных субъединиц, представляющих, а именно, эндоцеллюлазы, экзоцеллюлазы, целлобиазы, окислительные целлюлазы и фосфорилазы целлюлозы, при этом только экзоцеллюлазы и целлобиазы участвуют в фактическом гидролизе связи β (1 → 4). Количество субъединиц, составляющих целлюлосомы, также может определять степень активности фермента.

Многодоменные целлюлазы широко распространены среди многих таксономических групп, однако целлюлазы анаэробных бактерий, обнаруженные в целлюлосомах, имеют наиболее сложную архитектуру, состоящую из различных типов модулей. Например, Clostridium cellulolyticum продуцирует 13 модульных целлюлаз GH9, содержащих различное количество и расположение каталитического домена (CD), углеводсвязывающего модуля (CBM), докерина, линкера и Ig-подобного домена.

Комплекс целлюлазы из Trichoderma reesei , например, включает компонент, обозначенный C1 (57000 дальтон ), который разделяет цепи кристаллической целлюлозы, эндоглюканазы (около 52000 дальтон), экзоглюканазы (около 61000 дальтон) и бета-глюкозидазы (76000 дальтон). дальтон).

В геномах бактерий, продуцирующих целлюлосомы , были идентифицированы многочисленные «сигнатурные» последовательности, известные как докерины и когезины . В зависимости от их аминокислотной последовательности и третичной структуры целлюлазы делятся на кланы и семейства.

Мультимодульные целлюлазы более эффективны, чем свободный фермент (только с CD) из-за синергизма из-за непосредственной близости между ферментом и целлюлозным субстратом. CBM участвуют в связывании целлюлозы, тогда как гликозилированные линкеры обеспечивают гибкость CD для более высокой активности и защиты протеазы, а также повышенного связывания с поверхностью целлюлозы.

Механизм целлюлолиза

Три типа реакций, катализируемых целлюлазами: 1. Нарушение нековалентных взаимодействий, присутствующих в аморфной структуре целлюлозы (эндоцеллюлаза) 2. Гидролиз концов цепи для разрушения полимера на более мелкие сахара (экзоцеллюлаза) 3. Гидролиз дисахаридов и тетрасахаридов до глюкозы (бета-глюкозидаза).

Механические детали бета-глюкозидазной активности целлюлазы

Использует

Целлюлаза используется для производства кофе в коммерческих целях . Он выполняет гидролиз целлюлозы во время сушки бобов . Кроме того, целлюлазы широко используются в текстильной промышленности и в стиральных порошках. Они также использовались в целлюлозно-бумажной промышленности для различных целей и даже в фармацевтике. Целлюлаза используется при ферментации биомассы в биотопливо , хотя в настоящее время этот процесс является относительно экспериментальным. С медицинской точки зрения целлюлаза используется для лечения фитобезоаров, формы безоара целлюлозы, обнаруженного в желудке человека , и она продемонстрировала эффективность в разрушении полимикробных бактериальных биопленок путем гидролиза β (1-4) гликозидных связей в структурных экзополисахаридах матрикса внеклеточное полимерное вещество (EPS).

Измерение

Поскольку природный субстрат, целлюлоза , представляет собой нерастворимый в воде полимер, традиционные методы анализа восстанавливающего сахара с использованием этого субстрата не могут быть использованы для измерения активности целлюлазы. Ученые-аналитики разработали ряд альтернативных методов.

• Метод DNSA. Целлюлазную активность определяли путем инкубации 0,5 мл супернатанта с 0,5 мл 1% карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) в ​​0,05 М цитратном буфере (pH 4,8) при 50 ° C в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 3 мл реагента динитросалициловой кислоты. Поглощение считывали при 540 нм.

Вискозиметр может быть использован для измерения снижения вязкости раствора , содержащего водорастворимое производное целлюлозы , такие как карбоксиметилцеллюлоза при инкубации с образцом целлюлазы. Снижение вязкости прямо пропорционально активности целлюлазы. В то время как такие анализы очень чувствительны и специфичны для эндо -cellulase ( экзо -Актерских целлюлазы ферменты производят мало или вообще не изменение вязкости), они ограничены тем , что трудно определить активность в условных единицах фермента (микромолей субстрат или гидролизованный продукта, произведенного в минуту).

Целлоолигосахаридные субстраты

Целлоолигосахариды с более низким DP (DP2-6) достаточно растворимы в воде, чтобы действовать как жизнеспособные субстраты для ферментов целлюлазы. Однако, поскольку эти субстраты сами являются « редуцирующими сахарами », они не подходят для использования в традиционных анализах содержания восстанавливающего сахара, поскольку они генерируют высокое «холостое» значение. Однако их гидролиз, опосредованный целлюлазой, можно контролировать методами ВЭЖХ или IC, чтобы получить ценную информацию о потребностях в субстрате конкретного фермента целлюлазы.

Восстановленные целлоолигосахаридные субстраты

Целлоолигосахариды можно химически восстановить под действием боргидрида натрия с образованием соответствующих сахарных спиртов . Эти соединения не реагируют в тестах на восстановление сахара, но их продукты гидролиза реагируют. Это делает восстановленные борогидридом целлоолигосахариды ценными субстратами для анализа целлюлазы с использованием традиционных анализов на содержание восстанавливающего сахара, таких как метод Нельсона-Симоджи.

Окрашенные полисахаридные субстраты

Эти подложки можно разделить на два класса:

• Нерастворимые хромогенные субстраты: нерастворимый субстрат целлюлазы, такой как AZCL-HE-целлюлоза, абсорбирует воду и создает гелеобразные частицы при помещении в раствор. Этот субстрат постепенно деполимеризуется и растворяется под действием целлюлазы. Реакцию останавливают добавлением щелочного раствора, чтобы остановить активность фермента, и реакционную суспензию фильтруют или центрифугируют. Цвет фильтрата или надосадочной жидкости измеряется и может быть связан с активностью фермента.
• Растворимые хромогенные субстраты: образец целлюлазы инкубируют с водорастворимым субстратом, таким как азо-CM-целлюлоза, реакция прекращается и высокомолекулярные частично гидролизованные фрагменты осаждаются из раствора с органическим растворителем, таким как этанол или метоксиэтанол. Суспензию тщательно перемешивают, центрифугируют и измеряют цвет надосадочного раствора (из-за небольших растворимых окрашенных фрагментов). С помощью стандартной кривой можно определить активность фермента.

Реагенты, связанные с ферментами

Колориметрический и люминесцентно целлюлазы подложки могут быть использованы в присутствии вспомогательных бета-глюкозидаза для измерения удельного из эндо -cellulase активности

В последнее время , новые реагенты были разработаны , которые позволяют для измерения удельного от эндо -cellulase. Эти методы включают использование функционализированных олигосахаридных субстратов в присутствии вспомогательного фермента. В показанном примере фермент целлюлаза способен распознавать трисахаридный фрагмент целлюлозы и расщеплять эту единицу. Вспомогательный фермент, присутствующий в смеси реагентов (β-глюкозидаза), затем действует, чтобы гидролизовать фрагмент, содержащий хромофор или флуорофор. Анализ завершается добавлением основного раствора, который останавливает ферментативную реакцию и депротонирует высвобожденное фенольное соединение с образованием фенолятов. Целлюлазная активность данного образца прямо пропорциональна количеству высвободившегося фенолята, которое можно измерить с помощью спектрофотометра. Функционализация ацеталем на невосстанавливающем конце трисахаридного субстрата предотвращает действие вспомогательной β-глюкозидазы на исходный субстрат.

Смотрите также

• Целлюлоза 1,4-бета-целлобиозидаза , эффективная целлюлаза
• Единица целлюлазы , единица для количественной оценки активности целлюлазы

использованная литература

дальнейшее чтение