Альтернативная сварка - Alternative splicing

Альтернативный сплайсинг дает три изоформы белка . Белок A включает все экзоны, тогда как белки B и C возникают в результате пропуска экзонов .

Альтернативный сплайсинг или альтернативный сплайсинг РНК , или дифференциальный сплайсинг , является альтернативой сплайсинга процесс , в ходе экспрессии генов , что позволяет одному ген с кодом для нескольких белков . В этом процессе определенные экзоны гена могут быть включены или исключены из окончательной процессированной информационной РНК (мРНК), полученной из этого гена. Это означает, что экзоны соединяются в разных комбинациях, что приводит к разным (альтернативным) цепям мРНК. Следовательно, белки, транслируемые с альтернативно сплайсированных мРНК, будут содержать различия в их аминокислотной последовательности и, часто, в их биологических функциях (см. Рисунок). Примечательно, что альтернативный сплайсинг позволяет геному человека управлять синтезом гораздо большего количества белков, чем можно было бы ожидать от его 20 000 генов, кодирующих белок.

Альтернативный сплайсинг является нормальным явлением у эукариот , где он значительно увеличивает биоразнообразие белков, которые могут кодироваться геномом; у людей ~ 95% мультиэкзонных генов подвергаются альтернативному сплайсингу. Наблюдается множество способов альтернативного сплайсинга, наиболее распространенным из которых является пропуск экзона . В этом режиме конкретный экзон может быть включен в мРНК в одних условиях или в определенных тканях и исключен из мРНК в других.

Производство альтернативно сплайсированных мРНК регулируется системой транс-действующих белков, которые связываются с цис-действующими сайтами на самом первичном транскрипте . Такие белки включают активаторы сплайсинга, которые способствуют использованию определенного сайта сплайсинга, и репрессоры сплайсинга, которые сокращают использование определенного сайта. Механизмы альтернативного сращивания очень разнообразны, и постоянно находят новые примеры, особенно благодаря использованию высокопроизводительных методов. Исследователи надеются полностью выяснить регуляторные системы, участвующие в сплайсинге, чтобы альтернативные продукты сплайсинга из данного гена в определенных условиях («варианты сплайсинга») можно было предсказать с помощью «кода сплайсинга».

Аномальные вариации сплайсинга также связаны с заболеванием ; большая часть генетических нарушений человека возникает в результате вариантов сплайсинга. Также считается, что аномальные варианты сплайсинга способствуют развитию рака, а гены факторов сплайсинга часто мутируют при различных типах рака.

Открытие

Впервые альтернативный сплайсинг был обнаружен в 1977 году. Аденовирус продуцирует пять первичных транскриптов в начале своего инфекционного цикла, до репликации вирусной ДНК, и еще один позже, после начала репликации ДНК. Первые первичные транскрипты продолжают продуцироваться после начала репликации ДНК. Дополнительный первичный транскрипт, продуцируемый на поздних этапах заражения, является большим и происходит из 5/6 генома аденовируса размером 32 КБ. Это намного больше, чем любая мРНК отдельных аденовирусов, присутствующих в инфицированных клетках. Исследователи обнаружили, что первичный транскрипт РНК, продуцируемый аденовирусом типа 2 на поздней стадии, был сплайсирован множеством различных способов, в результате чего были получены мРНК, кодирующие различные вирусные белки. Кроме того, первичный транскрипт содержал несколько сайтов полиаденилирования , давая разные 3'-концы для процессированных мРНК.

В 1981 году был охарактеризован первый пример альтернативного сплайсинга транскрипта нормального эндогенного гена. Было обнаружено, что ген, кодирующий тироидный гормон кальцитонин, альтернативно сплайсирован в клетках млекопитающих. Первичный транскрипт этого гена содержит 6 экзонов; кальцитонин мРНК содержит экзоны 1-4 и заканчивается после полиаденилирования сайта в экзоне 4. Еще одна мРНК получают из этого пре-мРНК путем пропуска экзона 4, и включает в себя экзонов 1-3, 5 и 6. Он кодирует белок , известный как CGRP ( пептид, родственный гену кальцитонина ). Примеры альтернативного сплайсинга транскриптов генов иммуноглобина у млекопитающих также наблюдались в начале 1980-х годов.

С тех пор было обнаружено, что альтернативный сплайсинг повсеместен у эукариот. Рекордсменом по альтернативному сплайсингу является ген Dscam D. melanogaster , который потенциально может иметь 38 016 вариантов сплайсинга.

В 2021 году было обнаружено, что геном аденовируса типа 2, аденовируса, в котором впервые был идентифицирован альтернативный сплайсинг, способен производить гораздо большее разнообразие мРНК, чем считалось ранее. Используя технологию секвенирования нового поколения, исследователи смогли обновить транскриптом человеческого аденовируса типа 2 и представить ошеломляющую уникальную мРНК 904, продуцируемую вирусом посредством сложной схемы альтернативного сплайсинга.

Режимы

Традиционная классификация основных типов альтернативных событий сплайсинга РНК. Экзоны представлены синими и желтыми блоками, интроны - линиями между ними.
Относительные частоты типов альтернативных событий сплайсинга у людей и плодовых мух различаются.

Общепризнанно пять основных режимов альтернативного сращивания.

  • Пропуск экзона или кассетный экзон : в этом случае экзон может быть сплайсирован из первичного транскрипта или сохранен. Это наиболее распространенный вид пре-мРНК млекопитающих .
  • Взаимоисключающие экзоны : один из двух экзонов сохраняется в мРНК после сплайсинга, но не оба.
  • Альтернативный донорный сайт : используется альтернативное 5'-сплайсинговое соединение (донорский сайт), изменяющее 3'-границу вышестоящего экзона.
  • Альтернативный акцепторный сайт : используется альтернативный 3'-сплайсинговый сайт (акцепторный сайт), изменяющий 5'-границу нижележащего экзона.
  • Удержание интрона: последовательность может быть разделена на интрон или просто сохранена. Это отличается от пропуска экзона, потому что сохраненная последовательность не фланкируется интронами . Если сохраненный интрон находится в кодирующей области, интрон должен кодировать аминокислоты в рамке с соседними экзонами, иначе стоп-кодон или сдвиг в рамке считывания приведут к тому, что белок станет нефункциональным. Это самый редкий вид у млекопитающих.

В дополнение к этим основным способам альтернативного сплайсинга существуют два других основных механизма, с помощью которых разные мРНК могут генерироваться из одного и того же гена; множественные промоторы и множественные сайты полиаденилирования . Использование множественных промоторов правильно описано как механизм регуляции транскрипции, а не как альтернативный сплайсинг; Начав транскрипцию в разных точках, можно получить транскрипты с разными 5'-экзонами. С другой стороны, несколько сайтов полиаденилирования обеспечивают разные 3'-конечные точки для транскрипта. Оба этих механизма обнаруживаются в сочетании с альтернативным сплайсингом и обеспечивают дополнительное разнообразие мРНК, полученных из гена.

Схема отсечения от 3 структур сплайсинга в гене мышиной гиалуронидазы . Направленность транскрипции от 5 'до 3' показана слева направо. Экзоны и интроны не масштабированы.


Эти режимы описывают основные механизмы сращивания, но могут быть неадекватными для описания сложных событий сращивания. Например, на рисунке справа показаны 3 сплайс-формы из гена гиалуронидазы 3 мыши . Сравнение экзонной структуры, показанной в первой строке (зеленая), со структурой во второй строке (желтая) показывает удерживание интрона, тогда как сравнение между второй и третьей формой сплайсинга (желтый против синего) показывает пропуск экзона. Недавно была предложена модельная номенклатура для однозначного обозначения всех возможных схем сращивания.

Механизмы

Общий механизм сращивания

Сплайсосомный комплекс A определяет 5 'и 3' концы интрона перед удалением

Когда пре-мРНК транскрибируется из ДНК , она включает несколько интронов и экзонов . (У нематод среднее значение составляет 4–5 экзонов и интронов; у дрозофилы дрозофил может быть более 100 интронов и экзонов в одной транскрибируемой пре-мРНК.) Экзоны, которые должны сохраняться в мРНК , определяются в процессе сплайсинга. . Регулирование и выбор сайтов сплайсинга осуществляются транс-действующим активатором сплайсинга и репрессорными белками сплайсинга, а также цис-действующими элементами в самой пре-мРНК, такими как энхансеры экзонного сплайсинга и сайленсеры экзонного сплайсинга.

Типичный ядерный интрон эукариот имеет согласованные последовательности, определяющие важные области. Каждый интрон имеет последовательность GU на 5'-конце. Рядом с 3-м концом есть филиал. Нуклеотид в точке ветвления всегда представляет собой A; консенсус по поводу этой последовательности несколько различается. У человека консенсусной последовательностью сайта ветвления является yUnAy. За сайтом ветвления следует ряд пиримидинов - полипиримидиновый тракт - затем на 3'-конце идет AG.

Сплайсинг мРНК осуществляется комплексом РНК и белка, известным как сплайсосома , содержащим snRNP, обозначенные как U1, U2 , U4, U5 и U6 (U3 не участвует в сплайсинге мРНК). U1 связывается с 5 'GU, а U2 с помощью белковых факторов U2AF связывается с точкой ветвления A внутри сайта ветвления. Комплекс на этой стадии известен как комплекс сплайсосомы А. Формирование комплекса A обычно является ключевым этапом в определении концов интрона, подлежащего сплайсингу, и определении концов экзона, которые необходимо сохранить. (Номенклатура U основана на их высоком содержании уридина).

Связывается комплекс U4, U5, U6, а U6 замещает позицию U1. U1 и U4 уходят. Оставшийся комплекс затем выполняет две реакции переэтерификации . При первой переэтерификации 5'-конец интрона отщепляется от расположенного выше экзона и присоединяется к сайту разветвления A 2 ', 5'- фосфодиэфирной связью. При второй переэтерификации 3'-конец интрона отщепляется от нижележащего экзона, и два экзона соединяются фосфодиэфирной связью. Затем интрон высвобождается в форме лариата и разрушается.

Регуляторные элементы и белки

Сращивание репрессий

Сплайсинг регулируется транс-действующими белками (репрессорами и активаторами) и соответствующими цис-действующими регуляторными сайтами (сайленсерами и энхансерами) на пре-мРНК. Однако, как часть сложности альтернативного сращивания, следует отметить, что влияние фактора сращивания часто зависит от положения. То есть фактор сплайсинга, который служит активатором сплайсинга, когда он связан с интронным элементом энхансера, может служить репрессором, когда он связан с его элементом сплайсинга в контексте экзона, и наоборот. Вторичная структура транскрипта пре-мРНК также играет роль в регулировании сплайсинга, например, путем объединения элементов сплайсинга или маскирования последовательности, которая в противном случае служила бы элементом связывания для фактора сплайсинга. Вместе эти элементы образуют «код сращивания», который определяет, как сращивание будет происходить в различных клеточных условиях.

Есть два основных типа цис-действующих элементов последовательности РНК, присутствующих в пре-мРНК, и они имеют соответствующие транс-действующие РНК-связывающие белки . Сплайсинг глушители сайты , к которым сплайсинг репрессор белкам связываются, уменьшая вероятность того, что соседний участок будет использоваться в качестве сращивания перехода. Они могут быть расположены в самом интроне (сайленсеры интронного сплайсинга, ISS) или в соседнем экзоне ( сайленсеры экзонного сплайсинга , ESS). Они различаются по последовательности, а также по типам белков, которые с ними связываются. Большинство репрессоров сплайсинга представляют собой гетерогенные ядерные рибонуклеопротеиды (hnRNP), такие как hnRNPA1 и белок, связывающий полипиримидиновый тракт (PTB). Энхансеры сплайсинга - это сайты, с которыми связываются белки-активаторы сплайсинга, увеличивая вероятность того, что соседний сайт будет использоваться в качестве соединения сплайсинга. Они также могут возникать в интроне (энхансеры интронного сплайсинга, ISE) или экзоне ( энхансеры экзонного сплайсинга , ESE). Большинство белков-активаторов, которые связываются с ISE и ESE, являются членами семейства белков SR . Такие белки содержат мотивы распознавания РНК и домены, богатые аргинином и серином (RS).

Активация сварки

В общем, детерминанты сращивания работают взаимозависимым образом, который зависит от контекста, так что правила, управляющие тем, как сращивание, регулируются из кода сращивания. Присутствие определенного цис-действующего элемента последовательности РНК может увеличить вероятность того, что соседний сайт будет сплайсирован в некоторых случаях, но снизит вероятность в других случаях, в зависимости от контекста. Контекст, в котором действуют регуляторные элементы, включает цис-действующий контекст, который устанавливается присутствием других характеристик последовательности РНК, и транс-действующий контекст, который устанавливается клеточными условиями. Например, некоторые цис-действующие элементы последовательности РНК влияют на сплайсинг, только если несколько элементов присутствуют в одной и той же области, чтобы установить контекст. В качестве другого примера, цис-действующий элемент может иметь противоположные эффекты на сплайсинг, в зависимости от того, какие белки экспрессируются в клетке (например, нейрональный PTB по сравнению с ненейрональным). Адаптивное значение сайленсеров и энхансеров при сплайсинге подтверждается исследованиями, показывающими, что в генах человека существует сильный отбор против мутаций, которые производят новые сайленсеры или разрушают существующие энхансеры.

Метилирование ДНК и альтернативный сплайсинг у социальных насекомых

Метилирование ДНК CpG показало свою роль в регулировании альтернативного сплайсинга у социальных насекомых. У медоносных пчел ( Apis mellifera ) метилирование ДНК CpG, по-видимому, регулирует пропуск экзонов, основываясь на первых нескольких геномных исследованиях после того, как был доступен геном медоносной пчелы. Метилирование ДНК CpG более широко регулирует альтернативный сплайсинг, не только влияет на пропуск экзонов, но также на удержание интронов и другие события сплайсинга.

Примеры

Пропуск экзона : Drosophila dsx

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК dsx

Пре-мРНК гена dsx D. melanogaster содержат 6 экзонов. У мужчин экзоны 1, 2, 3, 5 и 6 соединены с образованием мРНК, которая кодирует белок, регулирующий транскрипцию, необходимый для развития мужчин. У женщин экзоны 1,2,3 и 4 соединены, и сигнал полиаденилирования в экзоне 4 вызывает расщепление мРНК в этой точке. Полученная мРНК представляет собой белок, регулирующий транскрипцию, необходимый для развития самок.

Это пример пропуска экзона. Интрон, расположенный выше экзона 4, имеет полипиримидиновый тракт , который не соответствует согласованной последовательности , поэтому белки U2AF плохо связываются с ним без помощи активаторов сплайсинга. Таким образом, этот 3'-акцепторный сайт сплайсинга не используется у мужчин. Самки же производят активатор сращивания Transformer (Tra) (см. Ниже). SR-белок Tra2 продуцируется у обоих полов и связывается с ESE в экзоне 4; если Tra присутствует, он связывается с Tra2 и вместе с другим белком SR образует комплекс, который помогает белкам U2AF связываться со слабым полипиримидиновым трактом. U2 рекрутируется в ассоциированную точку ветвления, и это приводит к включению экзона 4 в мРНК.

Альтернативные акцепторные сайты: Drosophila Трансформатор

Альтернативный сплайсинг генного продукта Drosophila Transformer .

Пре-мРНК гена трансформера (Tra) Drosophila melanogaster подвергаются альтернативному сплайсингу через режим альтернативного акцепторного сайта. Ген Tra кодирует белок, который экспрессируется только у женщин. Первичный транскрипт этого гена содержит интрон с двумя возможными акцепторными сайтами. У самцов используется восходящий акцепторный сайт. Это приводит к включению более длинной версии экзона 2 в обработанный транскрипт, включая ранний стоп-кодон . Полученная мРНК кодирует усеченный белковый продукт, который неактивен. Самки продуцируют основной белок, определяющий пол. Смертельный секс (Sxl). Белок Sxl представляет собой репрессор сплайсинга, который связывается с ISS в РНК транскрипта Tra рядом с восходящим акцепторным сайтом, предотвращая связывание белка U2AF с полипиримидиновым трактом. Это предотвращает использование этого соединения, сдвигая связывание сплайсосомы на расположенный ниже акцепторный сайт. Сплайсинг в этот момент обходит стоп-кодон, который вырезается как часть интрона. Полученная мРНК кодирует активный белок Tra, который сам является регулятором альтернативного сплайсинга других генов, связанных с полом (см. Dsx выше).

Определение экзона: рецептор Fas

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК рецептора Fas

Множественные изоформы белка рецептора Fas продуцируются альтернативным сплайсингом. Две обычно встречающиеся у человека изоформы продуцируются механизмом пропуска экзонов. МРНК, включающая экзон 6, кодирует мембраносвязанную форму рецептора Fas, которая способствует апоптозу или запрограммированной гибели клеток. Повышенная экспрессия рецептора Fas в клетках кожи, хронически подвергающихся воздействию солнца, и отсутствие экспрессии в раковых клетках кожи предполагает, что этот механизм может иметь важное значение для устранения предраковых клеток у людей. Если экзон 6 пропущен, полученная мРНК кодирует растворимый белок Fas, который не способствует апоптозу. Включение или пропуск экзона зависит от двух антагонистических белков, TIA-1 и белка, связывающего полипиримидиновый тракт (PTB).

  • 5'-донорный сайт в интроне ниже экзона 6 в пре-мРНК имеет слабое согласие с консенсусной последовательностью и обычно не связывается с snRNP U1. Если U1 не связывается, экзон пропускается (см. «А» на сопроводительном рисунке).
  • Связывание белка TIA-1 с интронным сайтом энхансера сплайсинга стабилизирует связывание U1 snRNP. Полученный комплекс 5'-донорных сайтов способствует связыванию фактора сплайсинга U2AF с 3'-сайтом сплайсинга перед экзоном посредством механизма, который еще не известен (см. B).
  • Экзон 6 содержит богатый пиримидином экзонный глушитель сплайсинга, ure6 , с которым может связываться PTB. Если PTB связывается, он ингибирует эффект 5'-донорного комплекса на связывание U2AF с акцепторным сайтом, что приводит к пропуску экзона (см. C).

Этот механизм является примером определения экзона при сплайсинге. Сплайсосома собирается на интроне, и субъединицы мяРНП сворачивают РНК, так что 5 'и 3' концы интрона соединяются. Однако недавно изученные примеры, подобные этому, показывают, что также существуют взаимодействия между концами экзона. В этом конкретном случае эти взаимодействия определения экзона необходимы, чтобы позволить связывание ядерных факторов сплайсинга до сборки сплайсосом на двух фланкирующих интронах.

Конкуренция репрессор-активатор: ВИЧ-1 tat экзон 2

Альтернативный сплайсинг tat экзона 2 ВИЧ-1

ВИЧ , ретровирус , вызывающий СПИД у людей, продуцирует единственный первичный транскрипт РНК, который альтернативно сплайсируется множеством способов с образованием более 40 различных мРНК. Равновесие между дифференцированно сплайсированными транскриптами обеспечивает множественные мРНК, кодирующие различные продукты, необходимые для размножения вирусов. Один из дифференциально сплайсированных транскриптов содержит ген tat , в котором экзон 2 является экзоном кассеты, который можно пропустить или включить. Включение экзона 2 tat в РНК регулируется конкуренцией между репрессором сплайсинга hnRNP A1 и SR-белком SC35. Внутри экзона 2 последовательность сайленсера экзонного сплайсинга (ESS) и последовательность энхансера экзонного сплайсинга (ESE) перекрываются. Если белок-репрессор A1 связывается с ESS, он инициирует совместное связывание множества молекул A1, распространяясь в 5'-донорный сайт перед экзоном 2 и предотвращая связывание основного фактора сплайсинга U2AF35 с полипиримидиновым трактом. Если SC35 связывается с ESE, он предотвращает связывание A1 и поддерживает 5'-донорный сайт в доступном состоянии для сборки сплайсосомы. Конкуренция между активатором и репрессором обеспечивает производство обоих типов мРНК (с экзоном 2 и без него).

Адаптивное значение

Альтернативный сплайсинг - одно из нескольких исключений из исходной идеи о том, что одна последовательность ДНК кодирует один полипептид ( гипотеза « Один ген - один фермент» ). Правильнее было бы сейчас сказать: «Один ген - много полипептидов». Внешняя информация необходима для того, чтобы решить, какой полипептид продуцируется с учетом последовательности ДНК и пре-мРНК. Поскольку методы регуляции передаются по наследству, это обеспечивает новые способы воздействия мутаций на экспрессию генов.

Было высказано предположение, что для эукариот альтернативный сплайсинг был очень важным шагом на пути к повышению эффективности, потому что информацию можно хранить гораздо более экономично. Несколько белков могут кодироваться одним геном, вместо того, чтобы требовать отдельного гена для каждого, что позволяет использовать более разнообразный протеом из генома ограниченного размера. Это также обеспечивает эволюционную гибкость. Единичная точечная мутация может привести к тому, что данный экзон будет иногда исключаться или включаться в транскрипт во время сплайсинга, что позволяет производить новую изоформу белка без потери исходного белка. Исследования идентифицировали внутренне неупорядоченные области (см. Внутренне неструктурированные белки ) как обогащенные неконституционными экзонами, что позволяет предположить, что изоформы белков могут проявлять функциональное разнообразие из-за изменения функциональных модулей в этих областях. Такое функциональное разнообразие, достигаемое изоформами, отражается в паттернах их экспрессии и может быть предсказано подходами машинного обучения. Сравнительные исследования показывают, что альтернативный сплайсинг предшествовал многоклеточности в эволюции, и предполагают, что этот механизм мог быть использован для помощи в развитии многоклеточных организмов.

Исследования, основанные на проекте « Геном человека» и другом секвенировании генома, показали, что у человека всего на 30% больше генов, чем у круглого червя Caenorhabditis elegans , и лишь примерно в два раза больше, чем у мухи Drosophila melanogaster . Это открытие привело к предположению, что предполагаемая большая сложность человека или позвоночных в целом может быть связана с более высокими показателями альтернативного сплайсинга у людей, чем у беспозвоночных. Однако исследование образцов по 100000 EST от человека, мыши, крысы, коровы, мухи ( D. melanogaster ), червя ( C. elegans ) и растения Arabidopsis thaliana не обнаружило больших различий в частоте альтернативно сплайсированных генов у людей. и любое другое испытанное животное. Другое исследование, однако, предположило, что эти результаты были артефактом различного количества EST, доступных для различных организмов. Когда они сравнили альтернативные частоты сплайсинга в случайных подмножествах генов от каждого организма, авторы пришли к выводу, что у позвоночных действительно более высокий уровень альтернативного сплайсинга, чем у беспозвоночных.

Болезнь

Изменения в механизме процессинга РНК могут привести к неправильному сплайсингу нескольких транскриптов, в то время как однонуклеотидные изменения в сайтах сплайсинга или цис-действующих регуляторных сайтах сплайсинга могут привести к различиям в сплайсинге одного гена и, следовательно, в мРНК, полученной из транскрипты мутантного гена. Исследование 2005 г., включающее вероятностный анализ, показало, что более 60% мутаций, вызывающих заболевания человека, влияют на сплайсинг, а не непосредственно на кодирующие последовательности. Более недавнее исследование показывает, что одна треть всех наследственных заболеваний, вероятно, связана со сплайсингом. Независимо от точного процента, существует ряд заболеваний, связанных со сплайсингом. Как описано ниже, ярким примером заболеваний, связанных со сплайсингом, является рак.

Аномально сплайсированные мРНК также обнаруживаются в большом количестве раковых клеток. Комбинированный анализ РНК-Seq и протеомики выявил поразительную дифференциальную экспрессию изоформ сплайсинга ключевых белков в важных путях развития рака. Не всегда ясно, вносят ли такие аберрантные паттерны сплайсинга вклад в злокачественный рост или являются просто следствием клеточных аномалий, связанных с раком. Было показано, что для определенных типов рака, таких как колоректальный рак и рак простаты, количество ошибок сплайсинга на рак сильно различается между отдельными видами рака, и этот феномен называется нестабильностью транскриптома . Кроме того, было показано, что нестабильность транскриптома коррелирует со сниженным уровнем экспрессии генов факторов сплайсинга. Мутация Dnmt3a была продемонстрирована содействовать гематологические злокачественные опухолям , и что Dnmt3a -mutated клеточных линии демонстрируют транскрипт нестабильности по сравнению с их изогенным диким типом коллегами.

Фактически, в раковых клетках количество альтернативных вариантов сплайсинга сокращается по сравнению с нормальными клетками, и типы сплайсинга различаются; например, раковые клетки показывают более высокие уровни удержания интронов, чем нормальные клетки, но более низкие уровни пропуска экзонов. Некоторые различия в сплайсинге раковых клеток могут быть связаны с высокой частотой соматических мутаций в генах факторов сплайсинга, а некоторые могут быть результатом изменений в фосфорилировании транс-действующих факторов сплайсинга. Другие могут возникать в результате изменения относительного количества производимых факторов сплайсинга; например, было показано, что клетки рака груди имеют повышенные уровни фактора сплайсинга SF2 / ASF . Одно исследование показало, что относительно небольшой процент (383 из более чем 26000) альтернативных вариантов сплайсинга был значительно выше по частоте в опухолевых клетках, чем в нормальных клетках, предполагая, что существует ограниченный набор генов, которые при неправильном сплайсинге вносят вклад в опухоль. разработка. Однако считается, что вредные эффекты неправильно сплайсированных транскриптов обычно защищены и устраняются клеточным посттранскрипционным механизмом контроля качества, называемым нонсенс-опосредованным распадом мРНК [NMD].

Одним из примеров конкретного варианта сплайсинга, связанного с раком, является один из генов DNMT человека . Три гена DNMT кодируют ферменты, которые добавляют метильные группы к ДНК, модификация, которая часто имеет регуляторные эффекты. Несколько аномально сплайсированных мРНК DNMT3B обнаружены в опухолях и линиях раковых клеток. В двух отдельных исследованиях экспрессия двух из этих аномально сплайсированных мРНК в клетках млекопитающих вызвала изменения в паттернах метилирования ДНК в этих клетках. Клетки с одной из аномальных мРНК также росли в два раза быстрее, чем контрольные клетки, что указывает на прямой вклад этого продукта в развитие опухоли.

Другой пример - протоонкоген Рона ( MST1R ) . Важным свойством раковых клеток является их способность перемещаться и проникать в нормальные ткани. Было обнаружено, что производство аномально сплайсированного транскрипта Ron связано с повышенными уровнями SF2 / ASF в клетках рака груди. Аномальная изоформа белка Ron, кодируемая этой мРНК, приводит к подвижности клеток .

Сверхэкспрессия усеченного варианта сплайсинга гена FOSB - ΔFosB - в конкретной популяции нейронов в прилежащем ядре была идентифицирована как причинный механизм, участвующий в индукции и поддержании зависимости от наркотиков и естественных наград .

Недавние провокационные исследования указывают на ключевую функцию модификаций структуры хроматина и гистонов в альтернативной регуляции сплайсинга. Эти идеи предполагают, что эпигенетическая регуляция определяет не только то, какие части генома экспрессируются, но и то, как они сплайсируются.

Полногеномный анализ

Полногеномный анализ альтернативного сплайсинга - сложная задача. Обычно альтернативно сплайсированные транскрипты были обнаружены путем сравнения последовательностей EST , но для этого требуется секвенирование очень большого количества EST. Большинство библиотек EST происходят из очень ограниченного числа тканей, поэтому тканеспецифичные варианты сплайсинга, вероятно, будут упущены в любом случае. Однако были разработаны высокопроизводительные подходы к исследованию сплайсинга, такие как: анализы на основе микрочипов ДНК, анализы связывания РНК и глубокое секвенирование . Эти методы можно использовать для скрининга полиморфизмов или мутаций в элементах сплайсинга или вокруг них, которые влияют на связывание с белками. Затем в сочетании с анализами сплайсинга, включая анализы репортерных генов in vivo, можно проанализировать функциональные эффекты полиморфизмов или мутаций на сплайсинг транскриптов пре-мРНК.

В анализе микрочипов, массивы фрагментов ДНК , представляющих отдельные экзоны ( например , Affymetrix экзон микрочипов) или экзон / экзон границы ( например , массивы из ExonHit или Дживан были использованы). Затем массив зондируют меченой кДНК из представляющих интерес тканей. КДНК зонда связываются с ДНК из экзонов, которые включены в мРНК в их ткани происхождения, или с ДНК из границы, где были соединены два экзона. Это может выявить присутствие конкретных мРНК, подвергнутых альтернативному сплайсингу.

CLIP ( перекрестное связывание и иммунопреципитация ) использует УФ-излучение для связывания белков с молекулами РНК в ткани во время сплайсинга. Затем представляющий интерес транс-действующий регуляторный белок сплайсинга осаждают с использованием специфических антител. Когда РНК, прикрепленная к этому белку, выделяется и клонируется, она выявляет целевые последовательности для этого белка. Другим методом идентификации РНК-связывающих белков и картирования их связывания с транскриптами пре-мРНК является «Оценка геномных аптамеров на микрочипах по сдвигу (MEGAshift)». Net Этот метод включает адаптацию «Систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения» (SELEX) "вместе со считыванием на основе микрочипов. Использование метода MEGAshift предоставило понимание регуляции альтернативного сплайсинга, позволяя идентифицировать последовательности в транскриптах пре-мРНК, окружающих альтернативно сплайсированные экзоны, которые опосредуют связывание с различными факторами сплайсинга, такими как ASF / SF2 и PTB. Этот подход также использовался для определения взаимосвязи между вторичной структурой РНК и связыванием факторов сплайсинга.

Технологии глубокого секвенирования использовались для проведения полногеномного анализа мРНК - необработанных и обработанных - что дает представление об альтернативном сплайсинге. Например, результаты использования глубокого секвенирования показывают, что у людей около 95% транскриптов мультиэксонных генов подвергаются альтернативному сплайсингу, при этом ряд транскриптов пре-мРНК сплайсируются тканеспецифическим образом. Функциональная геномика и вычислительные подходы, основанные на многократном обучении , также были разработаны для интеграции данных RNA-seq для прогнозирования функций для альтернативно соединенных изоформ. Глубокое секвенирование также помогло в обнаружении in vivo преходящих лариатов , которые высвобождаются во время сплайсинга, определении последовательностей сайтов ветвления и крупномасштабном картировании точек ветвления в транскриптах пре-мРНК человека.

Использование репортерных анализов позволяет найти белки сплайсинга, участвующие в конкретном альтернативном событии сплайсинга, путем конструирования репортерных генов, которые будут экспрессировать один из двух различных флуоресцентных белков в зависимости от происходящей реакции сплайсинга. Этот метод был использован для выделения мутантов, влияющих на сплайсинг, и, таким образом, для идентификации новых регуляторных белков сплайсинга, инактивированных в этих мутантах.

Базы данных

Есть набор альтернативных баз данных для склейки. Эти базы данных полезны для поиска генов, имеющих пре-мРНК, которые подвергаются альтернативному сплайсингу и альтернативным событиям сплайсинга, или для изучения функционального воздействия альтернативного сплайсинга.

Смотрите также

использованная литература

внешние ссылки